副猪嗜血杆菌毒力菌株与非毒力菌株差异蛋白的筛选及鉴定

【摘要】副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是正常猪群上呼吸道的一种常见的共生菌,但在特定的条件下可以侵入机体,并引发以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等为主要特征的疾病,该病又被称为革拉瑟氏病(Glasser’sdisease)。最近副猪嗜血杆菌病已经成为猪场保育仔猪死亡的一个主要原因,但是引起其致病的原因仍然还不是很清楚。HPS常在健康猪的鼻腔、扁桃体、气管中分离到,因此区分出正常栖生菌株与致病性菌株是确诊该病的关键所在。毒力因子是区分致病与非致病菌株的重要标志物,目前,副猪嗜血杆菌的毒力因子尚未被阐明。蛋白质是生命体发挥生物学功能的真正载体,因此在蛋白质水平研究副猪嗜血杆菌的毒力因子将为建立区分致病性生菌株和非致病性菌株的鉴别诊断方法及致病机理提供了新的线索。本研究针对副猪嗜血杆菌临床分离株血清13型14A7-2和血清不定型20A3-2开展差异蛋白研究。根据其引起的临床症状、潜在毒力基因检测和动物感染实验的结果,确定14A7-2和20A3-2菌株分别为毒力菌株和非毒力菌株。提取14A7-2菌株和20A3-2菌株的菌体蛋白,优化HPS菌体蛋白双向电泳条件,确立最佳pH范围、胶条长度、聚焦时间和上样量等,成功地建立了分辨率高和重复性好的HPS菌体蛋白的2-DE图谱。通过Imagemaster2DPlatinum7.0软件分析两个菌株之间2-DE图谱差异和MALDI-TOF/MS质谱鉴定差异蛋白。在副猪嗜血杆菌毒力菌株中检测到596±10个蛋白质点而在非毒力菌株中检测到568±10个蛋白点,其中毒力菌株或非毒力菌株特有的蛋白点以及表达量差异达5倍以上蛋白点共有80个。选取毒力菌株或非毒力菌株特有的44个差异蛋白点进行质谱鉴定,成功鉴定42个蛋白点,对应37种蛋白。其中,毒力菌株特有蛋白27种,非毒力菌株特有蛋白5种。在毒力菌株特有蛋白中鉴定出潜在毒力因子铁摄取调节蛋白、触发因子、3-脱氢奎尼酸脱水酶等。鉴定出的这些差异蛋白为进一步研究HPS的毒力因子提供信息。根据本2-DE实验已鉴定的差异蛋白,从中选取毒力菌株特有的差异蛋白铁摄取调节蛋白(ferricuptakeregulationprotein)和3-脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinatedehydratase)及非毒力菌株特有的差异蛋白精氨酸ABC转运子(arginineABCtransporter,substrate-bindingprotein)进行进一步的差异性验证。分别以14A7-2和20A3-2菌株基因组DNA为模板PCR扩增相应基因,定向克隆到表达载体PET-28a(+)中,并表达和提纯蛋白,免疫小鼠制备抗血清,再以Western-blotting技术进行验证。结果表明铁摄取调节蛋白和3-脱氢奎尼酸脱水酶在毒力菌株14A7-2中的表达量明显高于其在非毒力菌株20A3-2中的表达量；精氨酸ABC转运子在非毒力菌株20A3-2中的表达量明显高于其在毒力菌株14A7-2中的表达量,它们可能是副猪嗜血杆菌的毒力因子。这为HPS毒力因子的寻找及其致病机理的研究提供一定的基础。
【作者】曹会敏；
【导师】王一成；姜平；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】副猪嗜血杆菌；菌体蛋白；比较蛋白质组学；差异蛋白；

【参考文献】
[1]吕松军.高师院校数学系学生数学观发展研究[D].湖南师范大学,课程与教学论,2004,硕士.
[2]徐挺.雷达探测仿真系统的研究与设计[D].杭州电子科技大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[3]李鹏.基于熵测度的短时心脏动力学分析[D].山东大学,生物医学工程,2014,博士.
[4]本报记者杜铭.LED照明：照亮世界的“绿光”[N].经济日报,2014-09-15015.
[5]聂志平.WTO背景下法治意识与依法行政[D].华东师范大学,马克思主义理论与思想政治教育,2003,硕士.
[6]肖诗轶.结构健康智能监测系统集成研究[D].武汉理工大学,计算机应用,2004,硕士.
[7]陈铁龙.杞菊合剂防治压力负荷性高血压大鼠左室肥厚的作用和机制探讨[D].浙江中医学院,中医内科学,2003,硕士.
[8]申华.基于视频的数据挖掘系统的研究[J].鞍山师范学院学报,2004,04:62-64.
[9]李帆.从海派文化特色创意园区的经验探讨洛阳文化创意产业的发展[D].华东师范大学,美术学,2013,硕士.
[10]任莹.新型城镇化背景下苏州新市民媒介呈现研究[D].苏州大学,新闻与传播（专业学位）,2014,硕士.
[11]刘金秋.斜拉桥施工过程中间索力的确定及其影响因素[D].大连理工大学,桥梁与隧道工程,2004,硕士.
[12]张全明,刘会金,兰泉妮,王建勋,金维刚.基于频谱分析的间谐波闪变效应计算[J].电力系统自动化,2009,09:67-72.
[13]樊富.中等职业学校《化工分析》课程的多媒体辅助教学实践研究[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[14]宏声.概说并行工程[J].质量与可靠性.1998(01)
[15]宋树成.双指数跳跃扩散模型下的几种期权定价[D].山东大学,运筹学与控制论,2013,硕士.
[16]陈光瑜.基于FAHP的云南省建筑业发展评价研究[D].西安建筑科技大学,土木工程建造与管理,2013,硕士.
[17]金菊良,吴开亚,魏一鸣.基于联系数的流域水安全评价模型[J].水利学报,2008,04:401-409.
[18]张秦玮.产品多目标意象造型进化设计研究[D].兰州理工大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[19]倪端.视听作品的著作权研究[D].中国政法大学,知识产权法,2014,硕士.
[20]乔寅飞.复方心痹汤对高脂饮食家兔血管内皮功能及炎症因子的影响[D].湖南中医药大学,中医内科学,2014,硕士.
[21]王雪.军队与地方：论新四军卫生工作[D].苏州大学,中国近现代史,2014,硕士.
[22]周长信.地方政府融资平台债务风险分析[J].企业改革与管理,2014,20:100-102.
[23]刘宇程,徐俊忠,张寅龙,袁建梅,陈明燕.废弃油基钻井液提取柴油剩余废弃物无害化处理研究[J].环境工程学报,2014,08:3417-3422.
[24]王芳.我国缺陷汽车召回法律制度研究[D].苏州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[25]张莹辉.履带起重机臂架低合金高强钢焊接工艺性研究[D].长安大学,机械工程（专业学位）,2013,硕士.
[26]欧阳玉洁.商品住宅成本与价格的变化态势分析[D].西南交通大学,数量经济学,2013,硕士.
[27]丁意然.微观视角下女性弹性退休选择动机研究[D].华东师范大学,社会保障,2013,硕士.
[28]王汀,江金财,俞志勇,徐骁.2013中国器官移植大会会议纪要[J].中华移植杂志(电子版),2014,01:45-49.
[29]文晓燕,郑琼林,韦克康,王琛琛.带零漂补偿和定子电阻自校正的磁链观测器[J].中国电机工程学报,2011,12:102-107.
[30]魏召阳.PAAS/PVA高吸水性树脂和水凝胶伤口敷料的制备及其性能研究[D].苏州大学,放射医学,2012,硕士.
[31]曹蒙春.HT沧州分公司提高顾客满意度策略研究[D].河北大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[32]孙秀欣.三联吡啶类过渡金属Ru（Ⅱ/Ⅲ）配合物的二阶非线性光学性质[D].东北师范大学,物理化学,2012,硕士.
[33]赵海军.约束条件下的量子博弈[D].湖南师范大学,理论物理,2004,硕士.
[34]徐娜.合肥市专利权质押融资策略研究[D].安徽大学,金融学,2013,硕士.
[35]周晓平.板冲压力机及其自动冲压线[J].一重技术.1994(03)
[36]王骞.云计算背景下中小企业信息资源管理研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[37]王婷.高中生语文学习性别差异研究[D].山东师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[38]梁志刚,李坤成.医学图像存储与传输系统[J].中国医学影像技术,2003,03:365-366.
[39]秦臻.专利产品平行进口问题研究[D].中国社会科学院研究生院,知识产权（专业学位）,2014,硕士.
[40]孙拥康.森林景观格局与环境关系的尺度效应研究[D].中南林业科技大学,森林经理学,2013,硕士.
[41]齐丽花.钢琴制造工艺与音律理论研究[D].山东艺术学院,音乐学,2012,硕士.
[42]王海霞.江西毛竹林雨雪冰冻灾后恢复与重建技术研究[D].江西农业大学,林业,2012,硕士.
[43]任玉婷,林建群,王新宇.街道空间中体验者的动态知觉特点研究[J].设计,2014,12:187-189.
[44]文强.祛湿健发汤治疗脂溢性脱发（湿热上蒸型）的临床观察[D].黑龙江中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[45]程林钢.基于内容管理的元数据的存储研究[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2010,硕士.
[46]胡姗.急性心肌梗死大鼠心电图ST段的演变特点及甘蔗叶多糖的保护作用[D].广西医科大学,心血管内科,2013,硕士.
[47]王泽建.凝胶多糖高产菌株的选育、发酵工艺条件优化及发酵动力学研究[D].广西大学,发酵工程,2004,硕士.
[48]张莹智.苏南水乡游览码头规划设计研究[D].苏州大学,设计艺术学,2014,硕士.
[49]徐正光,孙昌平.基于区间T-S模糊模型的运动模式预测[J].控制与决策,2012,11:1699-1705+1710.
[50]李悦.提升老字号企业营销执行力对策研究[D].沈阳理工大学,企业管理,2012,硕士.